La clonación por transferencia nuclear implica la transferencia de una célula diploide donante a un ovocito enucleado. A continuación, el complejo ovocito-célula se activa artificialmente para convertirse en un embrión, cuyo genoma nuclear es idéntico al del animal donante. Esta técnica, conocida como transferencia nuclear de células somáticas (SCNT, por sus siglas en inglés), permite producir clones genéticamente idénticos del donante.
Por lo general, el embrión clonado se desarrolla en el laboratorio hasta la etapa de blastocisto, después de lo cual se puede criopreservar o transferir a una hembra sustituta para que lo geste, lo que da como resultado una descendencia genéticamente idéntica al donante.
Aunque el genoma nuclear del clon es idéntico al genoma del animal donante, factores como el ADN mitocondrial y las modificaciones epigenéticas pueden influir en el fenotipo final del clon.
La clonación en animales domésticos se aplica más comúnmente en caballos, vacas, perros y camellos. En la práctica veterinaria, se utiliza principalmente para reproducir animales reproductores de élite; editar genes; preservar la genética de individuos de alto rendimiento, valiosos o de compañía; o para contribuir a la conservación de razas raras o en peligro de extinción.
Técnicas de clonación y selección de células de donantes
La selección de la célula donante ha sido una de las áreas más ampliamente exploradas en la investigación de la clonación. Las células derivadas de embriones tempranos, hasta la etapa de mórula, son muy eficientes como células donantes. La clonación mediante células embrionarias se llevó a cabo con éxito durante más de una década antes del nacimiento histórico del primer mamífero producido a través de la transferencia nuclear de células somáticas adultas: Dolly, una oveja clonada por el Instituto Roslin en Escocia en 1996.
A diferencia de la clonación a partir de células madre embrionarias, la SCNT, que utiliza células somáticas diferenciadas como donantes nucleares, ofrece la clara ventaja de duplicar genética probada de animales adultos.
Entre las células somáticas, el tejido conectivo subcutáneo es la fuente más común utilizada para la clonación de animales adultos. El tejido se desagrega mecánicamente y se cultiva in vitro, donde los fibroblastos crecen y se cosechan para su paso en nuevas placas de cultivo para promover la proliferación. Este proceso se repite hasta que se producen millones de células, que luego se criopreservan para futuras aplicaciones de clonación.
Los estudios han sugerido que el uso de células madre podría mejorar la eficiencia de la clonación de animales. Esto sigue siendo un tema de debate; sin embargo, las empresas de clonación comercial están adoptando cada vez más células madre derivadas de la médula ósea para la clonación de caballos.
Para que la transferencia nuclear sea exitosa, se requieren ovocitos maduros de la misma especie o de subespecies estrechamente relacionadas. Aunque el valor genético de los ovocitos no es crítico, su composición mitocondrial podría influir en el resultado, ya que el clon resultante hereda las mitocondrias del ovocito huésped.
Por lo general, los ovocitos se recuperan de material del matadero o, en algunas especies, se recolectan de animales vivos mediante la recolección de óvulos (ovum pickup, OPU) y posteriormente se maduran in vitro. En algunas especies, como los perros, los ovocitos maduros deben obtenerse de folículos preovulatorios o directamente del oviducto después de la ovulación.
La transferencia nuclear se realiza bajo un microscopio utilizando herramientas de micromanipulación como se indica a continuación:
Se eliminan los cromosomas (ADN genómico) del ovocito, creando un ovocito enucleado u ooplasto. La célula somática seleccionada para la clonación debe estar sincronizada con una fase temprana del ciclo celular, normalmente antes de la síntesis de ADN (fase G0-G1).
La célula somática se fusiona con el ooplasto a través de la fusión de la membrana inducida por un pulso eléctrico o por inyección directa.
El ovocito recombinado, que ahora contiene el núcleo de la célula del donante, se activa artificialmente para imitar la señal de fertilización, lo que hace que el ovocito comience el desarrollo embrionario.
Estos pasos también se pueden realizar con ovocitos a los que se les ha extirpado la zona pelúcida después de la maduración in vitro. Esta técnica, conocida como clonación «sin zonas», simplifica algunos de los pasos de la clonación; sin embargo, requiere un sistema de cultivo especial para mantener las células embrionarias cerca unas de otras durante la división.
La tecnología de transferencia nuclear se ha utilizado con éxito en gatos, perros y la mayoría de las especies domésticas grandes. Después de la activación de los ovocitos, el embrión en desarrollo puede transferirse quirúrgicamente al oviducto de una hembra receptora (práctica común para especies como los perros), o puede cultivarse in vitro hasta que alcance una etapa adecuada para la criopreservación o la transferencia transcervical (no quirúrgica) al útero (práctica estándar para los grandes mamíferos domésticos).
Salud y fenotipo en técnicas de selección y clonación de células donantes
Varios factores, incluidos los efectos epigenéticos, el ADN mitocondrial, el entorno uterino y posnatal, las mutaciones y la variación individual, influyen en la salud y el fenotipo de los individuos clonados.
Perlas y trampas
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Efectos epigenéticos
Después de la transferencia nuclear, el ooplasto debe reprogramar el ADN de la célula somática para que funcione igual que el de un cigoto. Esta reprogramación está regulada predominantemente a través de mecanismos epigenéticos, como la metilación del ADN y la modificación de histonas. Estos procesos controlan colectivamente la transcripción génica sin alterar la secuencia de ADN en sí, fenómeno conocido como regulación epigenética.
La capacidad del ovocito para reprogramar con precisión el ADN de la célula donante durante la clonación es crucial. El establecimiento adecuado y el mantenimiento de la marca epigenética a lo largo de las diversas etapas del desarrollo embrionario son esenciales para el desarrollo fetal exitoso.
Se cree que los errores en la reprogramación epigenética son importantes para el éxito o el fracaso de la clonación. Es posible que las imprecisiones menores en la reprogramación no afecten gravemente a la salud del individuo clonado, pero pueden dar lugar a diferencias fenotípicas con respecto al donante.
El primer gato clonado, CC, ofrece un ejemplo de variación epigenética en la clonación. Aunque el donante genético de CC era un gato calicó, CC solo expresaba color marrón en el pelaje. En los gatos calicó, el color del pelaje está determinado por la inactivación del cromosoma X, proceso en el que uno de los dos cromosomas X de las células femeninas se inactiva aleatoriamente. En CC, la inactivación del cromosoma X no fue aleatoria, probablemente debido a una reprogramación epigenética incompleta, lo que llevó a la activación solo del gen de color marrón.
La placenta es uno de los tejidos más susceptibles a la reprogramación epigenética anormal después de la SCNT. Muchas muertes de embriones clonados se han atribuido a una función placentaria anormal, que se ha relacionado con una regulación epigenética inadecuada durante el desarrollo temprano. Por lo tanto, las estrategias dirigidas a mejorar la regulación epigenética durante la clonación podrían mejorar en gran medida la eficiencia general del procedimiento. Sin embargo, muchos aspectos del proceso de reprogramación epigenética siguen siendo complejos y no se comprenden del todo.
Las diferencias epigenéticas también pueden influir en el fenotipo del animal clonado después del nacimiento. Por ejemplo, los cambios en la forma en que se expresan los genes relacionados con el crecimiento pueden hacer que algunos animales clonados crezcan más que otros, a pesar de que comparten el mismo ADN. Sin embargo, la investigación en múltiples especies ha demostrado que la mayoría de las anomalías epigenéticas observadas en animales clonados no se transmiten a su descendencia. Esto se debe a que durante la formación de espermatozoides y óvulos, la mayoría de las marcas epigenéticas se borran y se restablecen, lo que ayuda a garantizar que la próxima generación comience con borrón y cuenta nueva. Algunas marcas epigenéticas pueden escapar a esta reprogramación y transmitirse, pero la mayoría se restablecen, por lo que la clonación sigue siendo una herramienta atractiva para la cría, porque el riesgo de transmitir defectos epigenéticos a la descendencia es generalmente bajo.
ADN mitocondrial
El embrión clonado hereda el ADN nuclear de la célula donante, pero el ADN mitocondrial del ooplasto. Aunque es posible que persista una pequeña cantidad de mitocondrias de la célula del donante, por lo general son pocas en comparación con las mitocondrias del ovocito receptor.
El papel del ADN mitocondrial en la determinación de rasgos como la resistencia y la eficiencia metabólica sigue sin estar claro; sin embargo, es un área potencial de interés, particularmente en animales de producción. En algunos casos, los desajustes entre el ADN mitocondrial y el ADN nuclear pueden interrumpir procesos como el desarrollo de la placenta, lo que contribuye a embarazos anormales.
Los clones femeninos transmiten sus mitocondrias a su descendencia, lo que posiblemente resulte en una mezcla de mitocondrias donantes y hospedadoras. Sin embargo, el cuello de botella mitocondrial durante el desarrollo de los ovocitos significa que la proporción de cada tipo de mitocondrias heredada por la descendencia puede variar. En los clones masculinos, el ADN mitocondrial no se transmite a la descendencia, porque las mitocondrias paternas generalmente se eliminan después de la fertilización.
La producción de animales clonados con ADN mitocondrial genéticamente idéntico al del animal donante es posible si los ovocitos utilizados en el proceso son de la línea materna relacionada genéticamente con el animal donante. Esto se puede lograr recolectando óvulos a través de OPU.
Ambiente
Los factores ambientales, como la salud uterina, la nutrición, el ejercicio y la manipulación durante el desarrollo, pueden influir en el fenotipo de los animales clonados. Esta influencia es particularmente evidente cuando se espera que el fenotipo del animal clonado coincida con el del donante, pero exhibe una variabilidad que se debe a las diferencias en el entorno. Por ejemplo, CC, la gata clonada, mostraba rasgos de comportamiento distintos a los de su donante genético, probablemente porque fue criada en un entorno más estimulante.
Tales observaciones enfatizan que, aunque la identidad genética se conserva en los animales clonados, los factores ambientales pueden conducir a diferencias fenotípicas.
Este fenómeno también es evidente en los caballos, cuyas marcas blancas en el pelaje pueden variar en cantidad y ubicación entre los individuos clonados, a pesar de compartir composición genética. Estas variaciones en las marcas blancas en diferentes caballos clonados resaltan la influencia de los factores ambientales uterinos en el fenotipo (ver ).
Seis potros clonados del mismo animal donante. Los potros son muy similares en fenotipo, incluido el patrón general de color del pelaje. Sin embargo, los detalles del patrón (marcas blancas) muestran diferencias que se deben a la variación individual causada por la migración de células no coloreadas durante el desarrollo fetal.
Cortesía de Clonargen Biotech.
La diferenciación celular se produce en cascadas, ya que la diferenciación de un tipo celular afecta al estado de las células que lo rodean. Durante el desarrollo, la multiplicación celular y la apoptosis se producen como respuesta a muchos estímulos ambientales e internos. Por lo tanto, se producirán variaciones individuales aleatorias en la composición de los tejidos, incluso en individuos con el mismo origen genético.
Perlas y trampas
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Mutaciones genéticas
Las células utilizadas para la clonación, en particular las cultivadas in vitro, pueden acumular anomalías cromosómicas durante el pasaje. A medida que las células crecen y se dividen en cultivo, aumenta el riesgo de mutaciones, lo que puede afectar la viabilidad del embrión clonado. Sin embargo, la mayoría de los embriones derivados de células con anomalías cromosómicas importantes no llegan a término, lo que limita el impacto de tales mutaciones en los clones nacidos vivos.
Se informó que una yegua hembra clonada había nacido de un donante macho. Estudios posteriores revelaron la pérdida del cromosoma Y durante el cultivo celular o el proceso de clonación, lo que dio como resultado una hembra con un genotipo y fenotipo XO. Esta rara ocurrencia pone de relieve la posible inestabilidad cromosómica que puede surgir durante la clonación, particularmente con respecto a los cromosomas sexuales.
Estado de la clonación de animales domésticos
Se han producido crías vivas con éxito por transferencia nuclear en todas las principales especies de mamíferos domésticos, incluidos gatos, perros, caballos, vacas, búfalos, cabras, ovejas, cerdos y camellos.
Estado de la clonación de gatos
La clonación en gatos ha sido relativamente exitosa, con ovocitos a menudo obtenidos de tejido recuperado durante ovariohisterectomías. La clonación de gatos domésticos se utiliza principalmente para replicar mascotas, y su aplicación se ha ampliado para incluir esfuerzos de conservación de felinos salvajes en peligro de extinción mediante la clonación entre especies.
Aunque la tasa de éxito de la producción de gatitos vivos clonados sigue siendo modesta, sigue mejorando con los avances tecnológicos.
Estado de clonación de perros
Desde el nacimiento del primer perro clonado del mundo, Snuppy, en 2005, la SCNT se ha utilizado ampliamente para clonar varios tipos de perros para una variedad de propósitos. Sin embargo, la clonación de perros se enfrenta a importantes obstáculos biológicos.
La biología reproductiva canina es única, ya que es necesario extraer ovocitos maduros del oviducto después de la ovulación porque los métodos de maduración in vitro aún no son fiables. Además, los ciclos estrales en las perras ocurren solo aproximadamente dos veces al año, lo que limita la disponibilidad de ovocitos y complica la sincronización con los receptores.
A pesar de estos obstáculos, la clonación comercial de perros ha tenido éxito, y varias empresas han producido perros clonados para fines específicos, como preservar perros de trabajo de élite o animales de compañía queridos y apoyar la investigación en modelos animales. El proceso también se ha aplicado a los esfuerzos de conservación de especies en peligro de extinción, utilizando la tecnología SCNT para preservar el material genético.
Aunque la sincronización de los ovocitos sigue siendo un obstáculo, los continuos avances en las tecnologías reproductivas están haciendo que la SCNT en perros sea más accesible en diversos campos.
Estado de la clonación de caballos
Los caballos se clonan con frecuencia debido al alto valor de los individuos en deportes como el polo y el salto de obstáculos. La reproducción de animales castrados a través de SCNT también es una opción atractiva para algunos propietarios de caballos.
La experiencia de este autor con empresas de clonación en Argentina, así como estudios recientes, indican que la eficiencia de la clonación en caballos sigue siendo baja. Sin embargo, las tasas de desarrollo de blastocistos son ahora de hasta el 20 al 30 %, y el número de potros clonados ha aumentado, especialmente en Argentina y Estados Unidos. La eficiencia general de la clonación de caballos es de aproximadamente el 5 % (1, 2, 3).
Los clones de caballos son valorados por su rendimiento competitivo y han demostrado un éxito notable en las competiciones de élite. Las asociaciones de razas difieren en cuanto a si los caballos clonados pueden ser registrados para la competición. En Argentina se han producido hasta 15 clones del mismo donante. La preocupación por la variabilidad genética persistirá si la clonación no se gestiona con prudencia.
En particular, los ovocitos de caballos domésticos se han utilizado para clonar especies en peligro de extinción, como el caballo de Przewalski, en los EE. UU. La clonación exitosa de blastocistos de cebra utilizando ovocitos de caballo demuestra la flexibilidad genética dentro del género Equus.
Estado de la clonación de rumiantes
La clonación en bovinos y ovinos es menos eficiente que en caballos; sólo entre el 5 y el 15 % de los embriones transferidos dan lugar a descendencia viva (4). Una gran proporción de terneros y corderos clonados (30-50 %) mueren en los primeros 4 años de vida.
La clonación en el ganado vacuno y ovino a menudo se asocia con anomalías placentarias, incluida la disminución del número de cotiledones, y el síndrome de la descendencia grande (crecimiento fetal excesivo). Aunque los cambios que se han realizado en las condiciones del cultivo, como la disminución del suero, han mejorado los resultados, estos problemas no se han resuelto por completo.
El ganado clonado puede requerir atención médica extensa en el período neonatal debido a anomalías metabólicas; sin embargo, los supervivientes se comportan de forma similar a sus homólogos no clonados en la producción de leche y la agricultura.
La eficacia de la clonación caprina es similar a la de la clonación bovina; Aproximadamente el 10 % de los embriones transferidos dan lugar a nacidos vivos (5, 6). Sin embargo, los cabritos clonados tienden a exhibir una mayor viabilidad que los terneros y corderos clonados, posiblemente porque se utiliza la aspiración de folículos para la recuperación de los ovocitos.
Estado de la clonación de cerdos
La clonación de cerdos se ha vuelto cada vez más importante en el campo biomédico, particularmente por sus aplicaciones en el modelado de enfermedades y la investigación de trasplantes de órganos.
Los cerdos clonados están modificados genéticamente para replicar enfermedades humanas, lo que proporciona modelos valiosos para estudiar afecciones como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares y los trastornos neurodegenerativos. Los cerdos también se utilizan en la investigación de xenotrasplantes, en la que se exploran sus órganos como posibles candidatos para trasplantes humanos.
Sin embargo, la clonación de cerdos se enfrenta a varios obstáculos, incluida la baja eficiencia de la clonación, las altas tasas de mortinatos y los defectos del desarrollo, que dificultan el uso generalizado y requieren un mayor refinamiento.
La clonación en cerdos sigue siendo un reto; solo entre el 1 y el 5 % de los ovocitos recombinados producen crías vivas (7). Sin embargo, la clonación es factible porque se dispone de un gran número de ovocitos, lo que permite la transferencia de cientos de ovocitos recombinados a un único receptor.
Los cerdos clonados son generalmente sanos; sin embargo, experimentan tasas más altas de mortinatos y otras anomalías.
Estado de la clonación de camellos
La clonación de camellos ha avanzado desde el primer clon exitoso en 2009, y existe un gran potencial para mejorar las ganancias genéticas, particularmente en las comunidades de regiones áridas que dependen de los camellos por razones económicas y socioculturales.
La clonación ofrece la posibilidad de replicar animales de élite, independientemente de la edad que tengan o de si están vivos o muertos, y de producir un gran número de crías con sexo y genotipo predeterminados. Sin embargo, la baja eficiencia actual del proceso, incluida la supervivencia y el costo de los embriones, limita seriamente su viabilidad comercial, a pesar de sus claros beneficios para la cría y la preservación genética.
Aunque existen informes de crías de camello clonadas que llegan a término, se sabe poco sobre su estado de salud a largo plazo. Se necesita más investigación para evaluar la viabilidad y las posibles complicaciones de la clonación en esta especie.
Controversias y perspectivas de la clonación de animales domésticos
A pesar de sus beneficios, la clonación plantea problemas éticos. Los procedimientos de mejoramiento más estándar, como la transferencia convencional de embriones y la fertilización in vitro, comparten algunos riesgos. Estos riesgos se acentúan con la clonación, y deben sopesarse cuidadosamente en relación con los beneficios potenciales de la tecnología.
En la clonación agrícola, se han planteado preocupaciones sobre el impacto potencial en la diversidad genética, particularmente en especies como el ganado lechero, en el que un solo toro clonado podría engendrar miles de crías. Aunque las mismas preocupaciones se aplican a la inseminación artificial y a la distribución del semen, la clonación puede amplificar estos riesgos.
Algunos propietarios de caballos han producido hasta 15 copias genéticamente idénticas del mismo animal, lo que podría disminuir la variación genética cuando se combina la clonación con otras tecnologías reproductivas. Sin embargo, la clonación también puede mantener la diversidad genética cuando se aplica, por ejemplo, a animales castrados, que de otro modo estarían ausentes del acervo genético.
Las asociaciones de animales y razas deberían considerar la posibilidad de reglamentar el uso responsable de la clonación, sopesando tanto las ventajas como los riesgos para la diversidad genética.
Las preocupaciones sobre el efecto de la clonación de animales en la salud humana se centran principalmente en el consumo de alimentos producidos a partir de animales clonados. Después de años de estudio, la FDA y la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria han concluido que el consumo de carne o leche de animales clonados no representa ningún briesgo para la salud pública.
En la UE, aunque se reconoce la falta de pruebas de un riesgo para la salud humana, la comercialización de alimentos procedentes de clones requiere autorización. Se está pidiendo que la normativa de la UE prohíba la clonación con fines agrícolas y la comercialización de alimentos procedentes de clones.
Los argumentos contrarios a estas preocupaciones éticas son que la clonación ocurre en la naturaleza en forma de gemelos idénticos, que las personas han estado produciendo plantas y animales por medios «no naturales» desde la primera vez que plantaron una semilla en una nueva área o cruzaron una vaca con un toro seleccionado, y que esto es simplemente un nuevo desarrollo dentro del campo de la cría de animales domésticos.
Más de 10 años antes del nacimiento de Dolly se realizó una clonación embrionaria sin llamar la atención del público, incluso tampoco tuvo impacto público el nacimiento de dos corderos clonados a partir de células cultivadas de origen embrionario, que se anunció un año antes de que naciera Dolly. Por lo tanto, parece que la principal cuestión ética de interés público no es la producción de embriones sin fertilización, sino la producción de embriones a partir de células de un animal existente y conocido.
El costo de la clonación, especialmente en animales de compañía, sigue generando debate. Algunos ven este costo como una elección personal, pero otros lo ven como injustificable, particularmente dado que muchos animales de refugio necesitan un hogar. Las perspectivas culturales y religiosas también influyen en las opiniones, ya que algunos consideran aceptable la clonación y otros plantean preocupaciones.
Estos debates a menudo se cruzan con cuestiones éticas más amplias en las tecnologías reproductivas modernas que implican de manera similar la manipulación de animales con fines humanos.
La comercialización de la clonación conlleva la posibilidad de fraude y de aprovecharse de las emociones de los propietarios que han perdido a sus mascotas. Las empresas de clonación deben indicar claramente que la técnica producirá otro individuo con la misma dotación genética que el animal original; no «resucita» al animal ni crea un animal idéntico al donante (p. ej., con el mismo patrón de pelo o personalidad). La mejor analogía con un animal clonado es un gemelo idéntico nacido más tarde; al igual que con los gemelos idénticos naturales, serán muy similares pero también diferentes en muchos aspectos.
En un futuro próximo, las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) y otras tecnologías de células madre podrían revolucionar la clonación al permitir la producción de embriones mediante métodos in vitro que implican el cultivo de células madre. Las células madre pueden ser reprogramadas a partir de células adultas y utilizadas para crear embriones «clonados» sin la necesidad de la SCNT tradicional. Las tecnologías de células madre tienen el potencial de eludir muchas preocupaciones éticas e ineficiencias de la SCNT. A medida que avancen las investigaciones, estas tecnologías podrían permitir métodos más eficientes y éticamente aceptables de clonación.
Para más información
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Loi P, Palazzese L, Scapolo PA, Fulka J, Fulka H, Czernik M. Scientific and technological approaches to improve SCNT efficiency in farm animals and pets. Reproducción 2021;162(1):F33-F43.
Referencias
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